抗體的標記有哪些

抗體可以通過不同的化學試劑交聯到酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶），熒光染料（FITC、PE、APC等）、生物素（Biotin）、膠體金等。

　　一、抗體/蛋白的辣根過氧化物酶（HRP）標記

　　抗體標記HRP為經典的方法為NaIO4氧化法，現將HRP糖基氧化成醛基，醛基與抗體的-NH2反應生成希夫氏堿，抗體分子與HRP分子形成穩定結構。標記的時候一般按照抗體分子與HRP分子摩爾比1:4的比例進行標記，此時,兩者的質量約為1:1。

　　SOP抗體/蛋白的HRP標記（NaIO4氧化法）

　　標記以2mg抗體為例

　　1.抗體/蛋白的處理

　　1）待標記抗體/蛋白在50mM碳酸鹽緩沖液(0.015M Na2CO3,0.035M NaHCO3,pH9.6)中透析，其間換液2次，抗體/蛋白濃度調整為2mg/ml；或者將高濃度的抗體用0.5M碳酸鹽緩沖液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3,pH9.6)稀釋到2mg/ml，如果原抗體/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游離氨基的試劑，必須透析除去。

　　2.HRP酶的氧化

　　1）稱取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100μL ddH2O中。

　　2）稱取NaIO4 21mg，溶于1 mL的ddH2O中，吸取100μL NaIO4溶液與100μL的HRP溶液緩慢混合，4℃下靜置30min，此時溶液為綠色。

　　注意：此后的操作均在避光條件下進行。

　�。常┪��。拨蘈乙二醇緩慢加入氧化后的HRP溶液，室溫避光靜置30min，此時溶液為褐色。

　�。�.抗體的標記

　�。保�將氧化好的HRP溶液直接加入到已處理好的抗體/蛋白溶液中，室溫反應２小時。

　�。玻┓Q取0.4mg的NaBH4，溶解于20μL的ddH2O中，全部加入上步反應液中，4℃靜置2hr（不能再透析），每30min搖動一次。

　　3）PBS(pH7.2)透析過夜，標記液中加入體積比30%～50%的甘油，混勻后置于-20℃保存。

　　抗體/蛋白的HRP標記（戊二醛法）

　　參照多肽與載體偶聯相關SOP Frdbio GA(Glutaraldehyde,戊二醛)介導多肽與載體偶聯

　　二、抗體/蛋白的FITC標記

　　SOP FITC標記抗體/蛋白

　　1）將待標記的抗體/蛋白（濃度≧1mg/ml）對標記反應液(90mM NaHCO3，10mM Na2CO3，126mMNaCl,pH9.0)透析三次(4℃)。

　　2）將FITC(Frdbio)溶于DMSO中，濃度為20mg/ml。每次交聯使用的FITC均應新鮮配制，避光。

　　3）（抗體/蛋白質：FITC）=1mg:150μg的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻，避光4℃反應8hr。

　　4）加入5M的NH4Cl至終濃度50mM，4℃終止反應2hr。

　　5）將標記產物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。

　　6）交聯物的鑒定

　　蛋白濃度(mg/ml)=[A280–0.31×A495]/1.4

　　抗體/蛋白質：FITC比例=3.1×A495//【A280–0.31×A495]】，該值應介于2.5～6.5之間。

　　7）FITC標記的蛋白應置于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1%NaN3、1%BSA，30%甘油，短期保存于4℃避光，長期應該-20℃避光保存。

　　三、抗體/蛋白的生物素（Biotin）標記

　　一般每個抗體可以標記3-5個生物素，標記時，生物素與抗體的比率受抗體濃度影響，對于10 mg/ml的抗體溶液來說，生物素應超過蛋白12倍（摩爾數），對于2 mg/ml的抗體溶液應超過20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

　　蛋白樣品不得含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。

　　1、抗體/蛋白的前處理：

　　1）選擇適當截留的超濾柱中加入400μl標記反應溶液（0.1M PBS pH 7.2），加入1mg抗體，混勻。

　　2）4℃，6,000rpm，離心2min,棄濾液；于超濾柱中再加入200μl標記反應溶液，混勻。4℃，6,000rpm，離心2min,

　　3）重復步驟2 6到7次。

　　4）混勻超濾柱中的殘留的液體，室溫靜置1min；將超濾柱反轉倒置于一新的超濾管中，4℃，1000×g，2min，收集液體。

　　5）取50μl PBS于超濾柱中混勻，靜置1min。倒置超濾柱，4℃，6,000rpm，2min。收集液體。

　　6）步驟4與步驟5的收集的濾液合并，用標記反應溶液調節抗體濃度到2mg/ml，4℃放置備用。

　　2、生物素的標記：

　　7）將生物素溶解在其合適的溶劑中（請參照所選生物素的說明書，不同的生物素其溶劑不同），濃度為20mg/ml,按照生物素與抗體分子摩爾比1:20的比例加入抗體溶液，室溫反應1h。

　　8）葡聚糖凝膠分離純化/透析袋或者超濾管去除游離生物素及其他試劑。

　　9）將抗體保存于合適的抗體保存液

　　進行抗體標記的時候，需要對抗體性質、交聯劑和標記物的性質非常了解，否則很難標記出高品質的抗體；標記量低，導致信號值低；標記量太高，不但容易造成背景，并且還容易由于標記物的聚集造成信號拮抗，反而降低或者淬滅信號值。標記物的種類繁多，不同類型的標記物其性質完全不一樣，光是標記物都很難選擇和把握，建議初學者使用zhuanye的試劑盒進行標記，或者直接委托ZY化公司標記。優質抗原,抗體,培養基,his標簽抗體,羊抗鼠IgM,兔抗人IgM